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如何獲得精準的Western Blot實驗結果
點擊次數:5523 發布日期:2019-10-25  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
如何做出一手漂亮的Western Blot實驗結果
 
蛋白質免疫印跡雜交實驗(Western Blotting)是成熟 mRNA 翻譯指導蛋白質合成量分析檢測手段中最經典和最廣泛為業界認可的一種,也是論文中最常見的數據呈現形式之一。雖然Western Blot實驗原理比較簡單,但是實驗耗時長、步驟繁瑣和實驗結果重復性差,導致剛進實驗室的小伙伴們,實驗做的焦頭爛額。
那么如何做出一手漂亮的Western Blot實驗結果呢,請小伙伴們跟隨星博士的腳步,了解Western Blot實驗的相關知識,let's go!
 

 
Western Blotting實驗原理:
 
蛋白質印跡法(免疫印跡試驗)即Western Blot,簡稱WB。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色,將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質從凝膠轉移到固相支持物(NC膜或PVDF膜)上,然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術。
 

 
Western Blotting實驗步驟:
 

 
樣品制備
 
樣本制備是決定蛋白質免疫印跡是否成功的關鍵步驟之一。樣本必須進行研磨、勻漿、超聲處理。膜蛋白需用更劇烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還需要注意的一點就是組織中的蛋白酶活性更強,需要加入PMSF抑制酶的活性。思科捷為大家提供強、中、弱三種RIPA裂解液,以及適用于各種類型的蛋白酶抑制劑。
 

 
電泳分離
 
準備好樣品后,第二步就是上樣和電泳分離了,上樣之前小伙伴們要做的必要步驟是確定蛋白質濃度,根據蛋白質濃度確定上樣量。星博士給大家推薦BCA和Bradford兩款蛋白濃度測定試劑盒,小伙伴們可以根據自己的實驗需求自行選擇。
 
測完了蛋白質濃度,接下來就是上樣了。首先要制備凝膠,選用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(EC0003),簡單省時。然后安裝電泳槽,將膠片安置在電泳槽中,在電泳裝置中加入SDS-PAGE電泳液。思科捷提供10×的電泳液,稀釋后直接使用,方便快捷。
 

 
上樣結束后,設置電泳程序一般濃縮膠80V,分離膠120V,電泳時間一般為1-2小時,根據溴酚藍指示位置選擇停止電泳時間即可。
 
轉膜
 
針對特定分子量大小靶蛋白而選擇適當轉膜條件(轉膜時間,轉膜緩沖液和必要低溫環境)能夠將 SDS-PAGE 膠上蛋白樣品盡可能完全轉移到印跡膜上,同時減少蛋白不必要的降解,這對于最終獲得清晰、可信結果也是需要考慮因素。轉膜方式主要包括濕式電印跡法(最佳轉膜方法)、半干式電印跡(可選的替代轉膜方法)以及干式電印跡(有限靈敏度的轉膜方法)。根據實驗室習慣和需求,小伙伴們可以自行選擇轉膜方式。
 
膜的選擇
 
膜的選擇主要從實驗目的和實驗要求來考慮,例如做分子量小于20kDa的小蛋白,0.45um的膜是不可取的,因為可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結合的目的蛋白含量不確定,從而影響最終結果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白選擇0.2um的膜,而大于20KDa的蛋白選擇0.45um的膜。常見的膜有NC膜和PVDF膜,區別如下:
 
 
NC
PVDF
靈敏度和分辨率
背景
較高
結合能力
80-110ug/cm2
125-200ug/cm2
材料質地
干的NC膜易脆
機械強度高
溶劑耐受性
操作程序
緩沖液潤濕,避免氣泡
使用前100%甲醇潤濕
檢測方式
ECL檢測
ECL檢測
價格
較便宜
較貴
 
 
膜方式的選擇
 
濕轉:
 
通常我們在做濕轉的時候,選擇100V恒壓(高強度,因為低強度時間較長,且效率較低),電流控制在120-350mA之間,分子量在60KD以下的60分鐘即可,分子量在60KD以上的需要延長轉膜時間60-150分鐘才能確保高效率的轉膜。所以如果你所研究的兩個蛋白分子量差異比較大(如GAPDH 37KD,Ki67 358KD),你可以考慮將膠從中間分開,兩部分分別采用不同時間轉印,能達到你理想的效果。電轉液一般可以重復使用3次,之后電流會過大,不適合再使用。
 
濕轉
優點
缺點
轉膜條件靈活容易進行調整
Buffer加熱可能干擾轉印
多種Buffer可用于優化轉印
在轉印的時候需要制冷裝置
可以延長轉印時間
需要大量的轉膜緩沖液
可用于定量Western Blot
 
 

 
半干轉:
 
對于半干轉來說,也需要進行堆疊組裝(濾紙,膠,膜需要放在轉印buffer中進行預平衡)放在裝置電極板的底部,蓋上上極板,高強的電流通過三明治結構,轉印速度較快,一般小于1h。
 

 
半干轉
優點
缺點
轉膜速度快
低分子量蛋白容易轉過
用不連續的Buffer系統優化轉印的蛋白
對于分子量>120KDa的蛋白,轉印較困難
轉膜緩沖液用量少
轉膜過程容易干膠
容易安裝
對于定量的Western實驗不推薦使用
對于同一蛋白的多張膜的分析比較有益
 
 
需要注意的是:低溫對于膜的轉印是至關重要的,尤其是在轉印時間較長而無人監管的情況下。針對剛建的實驗室平臺或者一些新蛋白的研究,經過轉印的膠和膜都要通過染色確定轉膜效率(膠用考馬斯亮藍加熱染色,膜用麗春紅染色,均只需幾分鐘,并不耽誤太多時間),不然后面的實驗既費時也費抗體。
 
封閉
 
在做Western blot實驗中,因固相載體(如NC膜,PVDF膜)表面有很多孔,通過電轉,膠上的蛋白被轉移到膜上,蛋白以機械填補(堆積)和吸附的方式結合于表面。蛋白塞進了表面孔里面,但是蛋白并不是連續的,而有很多空隙,抗體也是蛋白,也會被吸附在空的洞里,這樣就會有很多非特異性的信號。
 
因為有“填補”和“覆蓋”蛋白結合位點以避免一抗的非特異性結合,所以有“封閉”的說法。星博士在此介紹常見封閉液的一些特點,有助于大家選擇:
 
常見的封閉液——BSA
 
BSA是最常用的封閉液,成分單一適用于大多數情況。若免疫原是偶聯BSA的,BSA有很強的免疫原性,會導致產生很多針對BSA的抗體,為避免交叉反應,不能用BSA,脫脂奶粉封閉,可以選用酪蛋白或無蛋白的封閉液。
 
常見的封閉液——脫脂奶粉
 
脫脂奶粉最大的優點是價格便宜,但由于成分相對復雜,所以適用范圍要狹窄一些。針對磷酸化蛋白的檢測不能用脫脂奶粉,脫脂奶粉含有酪蛋白,該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白,使用會造成高背景磷酸化抗體也許會導致背景增加,此外,因為自身含有生物素,不能用于生物素標記的抗體系統。
 
封閉體系并不是一成不變的,不同的封閉體系往往會得到不一樣的實驗結果,由此可見,做Western Blot實驗中,封閉液的選擇也是需要謹慎的。
 

不同封閉體系結果的差異
 
抗體孵育
 
一抗一般按照說明書進行稀釋后,室溫孵育1-2h,或者4℃過夜。為了讓抗體充分與蛋白結合,大多數實驗室一般會選擇4℃過夜。一抗孵育結束后TBST洗滌三次,用稀釋后的二抗,室溫孵育1-3小時,TBST洗滌三次。
 
抗體是決定Western Blot實驗成敗的最關鍵因素,選擇具有一定文獻引用數的品牌不僅更容易得到清晰可信的結果同時更能夠得到同行認可,針對一些表達峰度高且穩定的蛋白可以選擇國產化抗體,既能保證實驗結果準確性又可降低實驗成本,抗體的保存往往也是大家最容易忽略的一個環節,而因抗體保存不當造成實驗失敗的例子比比皆是。
 
保存溫度和條件(僅供參考)
 
對于很多抗體而言,分裝成小等份并凍存于-20℃或-80℃是最佳保存條件。分裝成小等份可最大程度減少由凍融造成的抗體效價降低,以及從單個試劑瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需凍融一次,如有剩余,可將剩余物保存于4℃,建議一周內用完。在收到抗體時,在10000×g下離心20秒以沉積截留于試劑瓶螺紋的溶液,并以小等份轉移至低蛋白結合微量離心管中。小等份的量取決于實驗人員在實驗中通常采用的量。小等份應不小于10μl;等份越小,儲液濃度因抗體蒸發及吸附于保存瓶表面而受到的影響越大。
 
在大多數情況下,收到抗體時在4℃下保存一至兩周,然后再冷凍進行長期保存是可以接受的,但也許腹水液是例外,它可能包含蛋白酶,因而應該盡快凍存。不同品牌的抗體保存方式往往不同,具體保存方式需參考產品說明書。
 
檢測
 
抗體孵育完,就到了Western Blot實驗的最后一步——檢測了。
 
目前最常用的檢測方法是ECL化學發光法,主要針對HRP標記的二抗。思科捷為大家提供極超敏和超敏兩種ECL發光液供大家選擇。一款合適的發光液能使你的Western Blot圖片更加美觀。
 

 
Western Blot的基礎部分就先講到這里,歡迎小伙伴們在評論區留言,針對Western Blot實驗的問題,星博士將一一為大家解答。
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